それでは、実際にCRISPR/Cas9システムを使用したゲノム編集について詳細に解説していきます。
CRISPR/Cas9システムを用いることにより、DNAの標的領域に2本鎖切断を誘導することができます。切断されたDNAを修復する機構が大きく分けて2つあり、それぞれが生命科学研究におけるゲノム編集技術として非常に重要なツールとしてはたらきます。まず1つ目が、非相同性末端結合修復(Non-Homologous End Joining: NHEJ)です。こちらは鋳型となる配列を使用せず、2本鎖切断の起こった領域をくっつけます。鋳型を利用しないので、元の配列がどのような配列だったか分からなくなり、修復の際に塩基の挿入(insertion)や欠損(deletion)が起こります。このような変異を”indel”と呼びます。例えば、タンパク質をコードする遺伝子配列の上流にindelを導入し、それ以降のアミノ酸の読み枠をずらす(フレームシフト)ことにより、標的タンパク質の欠損を行うことができます。これを”knock out”と呼び、興味のあるタンパク質を欠損させた時に、細胞や個体にどのような影響を及ぼすのか解析を行うことができます(図左)。
もう1つが、相同組換え修復(Homologous Recombination: HR)です。こちらは、DNA切断を誘導するときに、切断領域の5’側と3’側と同じ配列を持つ鋳型となるDNAを細胞に導入することにより、好きな遺伝子カセットの挿入を誘導することができます。このように、細胞のもつDNAの任意の位置に蛍光タンパク質などの配列を挿入することを”knock in”と呼びます。例えば、標的遺伝子の下流に蛍光タンパク質の配列をknock inすることによって、その遺伝子が機能している細胞を生きたまま顕微鏡などで観察することができるようになります(図右)。
このように、CRISPR/Casシステムを用いて、遺伝子を欠損させたり標識することによって、簡便に個体や細胞の解析を行うことができるようになりました。
CRISPR/Cas9を用いることにより、様々なゲノム配列を編集することができますが、一方で、ゲノムの切断を伴わない(標的遺伝子の配列を変えない)ことを利点とした応用法があります。Cas9タンパク質のニッカーゼ部位(ゲノムを切断するハサミのような部分)にアミノ酸置換を施し、2本鎖切断能を欠損させたdCas9(dead Cas9)にタンパク質を融合させることで、様々な解析を行うことができます。例えば、dCas9に転写抑制因子であるKRABを融合させたタンパク質を、gRNAによって標的遺伝子のプロモーター領域へリクルートすることにより、標的遺伝子のノックダウンを行うことができます(図左上)。逆に、dCas9に転写活性化因子であるVP64を融合させたタンパク質を用いることによって標的遺伝子の発現を活性化させることができます(図右上)。他には、GFPなどの蛍光タンパク質をdCas9に融合させることで、遺伝子の位置を可視化することができます(図下)。
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